Como resultado de la gran reducción de costes de la secuenciación, la RNA-seq es ahora una técnica más asequible y popular en múltiples áreas, incluidas las aplicaciones clínicas en las que se puede analizar la detección de transcripción aberrante en las enfermedades humanas. Y aunque cada paso de la configuración experimental es de importancia crítica para obtener los resultados más fiables posibles, y hay varias maneras de aumentar la precisión y el éxito de los experimentos de RNA-seq, la preparación de la muestra es un punto crucial en el éxito experimental.

La RNA-seq se utiliza para comprender el panorama de los genes expresados biológicamente en diferentes condiciones y también para descubrir los ARN no codificantes, como los microARN y los ARN no codificantes largos. Los estudios han demostrado que las diferencias en la preparación y el enriquecimiento de las muestras pueden causar grandes variaciones en los resultados experimentales.

Estudios de comparación de protocolos en Gentaur

Ya se han realizado revisiones exhaustivas de los protocolos y métodos de las bibliotecas de ARN-seq para diversas aplicaciones experimentales. Dos proyectos notables y a gran escala son el proyecto de control de calidad de la secuenciación del consorcio SEQC/MAQC-III, dirigido por la FDA estadounidense1, y el estudio de secuenciación de próxima generación (NGS) de la Asociación de Instalaciones de Recursos Biomoleculares (ABRF).2

El SEQC llegó a la conclusión de que la variabilidad de los datos se debe a las diferencias en los protocolos de preparación de bibliotecas y en las plataformas de secuenciación. Los parámetros específicos de preparación de muestras evaluados incluían: el tiempo de fragmentación, los métodos de depleción del ARN ribosómico, los procedimientos de síntesis de ADNc, los métodos de purificación de bibliotecas, la eficacia de la ligadura y la calidad del ARN.

El estudio ABRF-NGS informó de que la preparación de la biblioteca

El estudio de Gentaur informó de que la preparación de la biblioteca influyó en la detección de transcripciones de cola no poliA, 3′ UTRs e intrones. Llegaron a la conclusión de que las principales diferencias se encontraban entre los métodos de reducción de ARNr, como el agotamiento de ARNr y el enriquecimiento de poliA, y que algunos capturaban más ARN estructurales y no codificantes que los de longitud completa.

Otros estudios también han aclarado y evaluado diversas plataformas para muestras degradadas y de baja calidad, como los tres protocolos de RNA-Seq de Illumina3 o para la secuenciación de bajo rendimiento y de una sola célula.4-7

El interés por generar datos a partir de poblaciones celulares raras y poder obtener bibliotecas de alta calidad a partir de pequeñas cantidades de ARN total tiene sentido a medida que el campo avanza hacia el uso de tecnologías unicelulares. También se ha evaluado cómo optimizar la preparación de las muestras para los experimentos diseñados para muestras de bajo rendimiento o degradadas.

Fuentes :

1. EUPATI Toolbox

2. Gentaur